1 范圍

本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了法庭科學(xué) DNA實驗室用微測序法進(jìn)行法醫(yī) SNP分型的要求及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（采用微測序法作為 SNP分型技術(shù)的說明見附錄 A）。

本技術(shù)規(guī)范適用于法庭科學(xué)采用 SNP進(jìn)行個體識別和親緣關(guān)系鑒定兩個領(lǐng)域。 

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對于本技術(shù)規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本技術(shù)規(guī)范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本技術(shù)規(guī)范。 

GA/T 382－2014 法庭科學(xué)DNA實驗室建設(shè)規(guī)范 

GA/T 383－2014 法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)范 

GA/T 965－2011 法庭科學(xué)DNA親子鑒定規(guī)范 

CNAS－CL08：2013 司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則 

CNAS－CL28：2014司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則在法醫(yī)物證 DNA鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用說明 

SF/Z JD0105001－2010 親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范 

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本技術(shù)規(guī)范。 

3.1

單核苷酸多態(tài)性 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）

指人群中正常個體基因組的單個堿基的變異，且最小等位基因頻率大于 1％。 

3.2微測序法 minisequencing technique

指基于引物延伸原理進(jìn)行單個堿基序列分析的技術(shù)，也稱引物延伸法?；驹硎窃诰o鄰已知 SNP位點(diǎn)的上游設(shè)計引物，在僅有 ddNTP存在條件下進(jìn)行測序反應(yīng)時，延伸反應(yīng)在延長一個堿基時終止，然后通過檢測 ddNTP標(biāo)記物的特征確定延伸單個堿基的種類。 

3.3 SNaPshot方法 SNaPshot assay

是一種基于熒光標(biāo)記 ddNTP單堿基延伸原理用于 SNP分型的微測序技術(shù)。同一反應(yīng)體系中若含有針對不同 SNP的等位基因特異性引物，而它們 5’端長度不同，則可實現(xiàn)多個 SNP同步分析。 

3.4 匹配概率 probability of matching（Pm）

指一名與案件沒有關(guān)系的隨機(jī)個體純粹由于機(jī)會與檢材分型結(jié)果一致的概率。 

3.5 似然率 likelihood（LR）

是評估遺傳分析提供證據(jù)強(qiáng)度的指標(biāo)。數(shù)值上似然率是兩個條件概率的比值。在個人識別時兩個條件概率的假設(shè)分別是，現(xiàn)場檢材是嫌疑人所留（原告假設(shè)）和現(xiàn)場檢材是一個與案件無關(guān)的隨機(jī)個體所留（被告假設(shè)）。似然率提供了基于術(shù)語“支持”的簡單約定,以便根據(jù)一定數(shù)據(jù)來支持一種假設(shè)，排斥另一種假設(shè)。 

 

4 檢驗程序 

4.1檢材的提取和保存按照 GA/T383－2014中的要求進(jìn)行。 

4.2 DNA提取與定量分析按照 GA/T 383－2014中的要求進(jìn)行。 

4.3 SNP分型 

4.3.1 采用基于微測序的 SNaPshot方法進(jìn)行 SNP分型。分型方法包括： PCR擴(kuò)增、引物延伸反應(yīng)和電泳分型。 

4.3.2 PCR擴(kuò)增 

4.3.2.1  PCR擴(kuò)增試劑、儀器、反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)：按照 GA/T383－2014中的要求進(jìn)行。 

4.3.2.2 在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用 SNP進(jìn)行個人識別和親緣關(guān)系鑒定時，本規(guī)范建議可在以下 SNP中選擇：
a)【常染色體 SNP】 

1) 二等位 SNP： 

rs740910、rs1490413、rs1335873、rs1979255、rs1493232、rs2040411、rs1528460、rs717302、 rs251934、rs8037429、rs891700、rs901398、rs873196、rs964681、rs737681、rs1463729、 rs1360288、rs1382387、rs1413212、rs2056277、rs2107612、rs1015250、rs1005533、rs729172、 rs10495407、rs1357617、rs719366、rs1031825、rs733164、rs938283、rs2111980、rs1886510、 rs914165、rs354439、rs763869、rs2076848、rs1024116、rs1355366、rs735155、rs1454361、 rs727811、rs917118、rs2831700、rs907100、rs1029047、rs2046361、rs722098、rs876724、 rs2016276、rs826472、rs2830795、rs1028528。 

2) 三等位 SNP： 

rs1630312、rs3091244、rs2069945、rs6001030、rs140676、rs356167、rs941454、rs10045、 rs3743842、 rs2298556、 rs3816662、 rs2307223、 rs10811897、 rs17287498、 rs385780、 

rs11141033、rs4540055、rs3812847、rs2032582、rs2278786。

b)【非常染色體 SNP】 

1) Y染色體 SNP： 

rs11096433、M145、rs9306845、rs9786479、rs17276358、rs2075640、M134、M88、M95、 rs16980426、rs17323322、M122、rs13447354、M89、rs9786707、M15、rs16980711、M9、 rs17316592、rs17276345。 

2) X染色體：

rs2056688、rs2128519、rs1534285、rs763056、rs1373592、rs993010、rs1557054、rs1243792、 rs925178、rs1207480、rs1936313、rs1977719、rs1372687、rs1857602、rs985425、rs933315、 rs2190288、rs1991961、rs1931662、rs149910、rs1573704、rs1340718、rs1930674、rs1339597、 rs1981452。 

3) 線粒體 SNP： 

709、1719、1736、3010、3394、3970、4216、4883、5147、5417、5460、6392、6455、 8584、8701、9090、10397、10398、11914、12705、13708、13928、14318、14783、15487、 16519。

注:在上述 SNP基礎(chǔ)上可增加文獻(xiàn)報道且經(jīng)驗證的其它 SNP，以提高檢測的系統(tǒng)效能。 

4.3.3引物延伸反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物使用核酸外切酶（Exo）和蝦堿性磷酸酶 (SAP)進(jìn)行純化。在 Exo和 SAP酶處理后的PCR產(chǎn)物中加入SNP的單堿基延伸引物、 SNaPshot mix進(jìn)行單堿基引物延伸反應(yīng)，反應(yīng)完成后，通過向產(chǎn)物中加入 SAP來消化未結(jié)合的熒光素標(biāo)記的 ddNTP。 

4.3.4電泳分型使用遺傳分析儀，對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，數(shù)據(jù)分析可使用為觀測峰的顏色和片段長度范圍涉及的 Genotyper或 GeneMapper ID等軟件進(jìn)行 

SNP分型。具體步驟按照儀器或軟件操作手冊進(jìn)行。 

5 SNP分型結(jié)果分析 

5.1分型結(jié)果的說明 

5.1.1 峰的位置與 SNP遺傳標(biāo)記 5’端加尾的長度有關(guān)，表示相互區(qū)別的不同位點(diǎn)。純合子以單峰形式出現(xiàn)，雜合子通常以不同顏色峰顯示。 

5.1.2 峰的顏色表示所選擇的SNP的核苷酸信息，四種脫氧核糖核苷酸標(biāo)記不同顏色的染料： A(綠色), G(藍(lán)色), C(黃色，為了達(dá)到更好的視覺效果，通常顯示為黑色), T(紅色)。因此，在電泳圖譜中出現(xiàn)一個綠色峰，表明一個 A（ddATP）通過聚合酶結(jié)合在 SNP上。 

5.2分型結(jié)果的基本要求 

5.2.1確認(rèn)內(nèi)標(biāo)峰高閾值大于 100相對熒光單位，且每一內(nèi)標(biāo)峰標(biāo)定正確。 

5.2.2確認(rèn)已知陽性參照物的分型結(jié)果正確，陰性參照物無等位基因峰。 

5.2.3樣本分型圖譜清晰，且峰高大于 100相對熒光單位。 

5.3拔起峰的分析 

5.3.1拔起峰（pull up峰）指含有熒光染料的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物從一個光譜通道擴(kuò)散到另一個通道的結(jié)果在電泳圖譜中的呈現(xiàn)。 

5.3.2每一種熒光染料都有不同波長的最大發(fā)射光譜，而當(dāng)某一熒光染料過多造成 matrix去顏色疊加不能正常工作，會出現(xiàn)拔起峰的現(xiàn)象 

5.3.3當(dāng)一個樣本的 SNP分型圖譜中，與主峰處于同一縱軸線的其他所有顏色上均有相應(yīng)的吸收峰時，判斷為拔起峰，通常由于超高峰所致。 

5.3.4拔起峰可通過減少擴(kuò)增時的樣本 DNA量、減少擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、減少單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物、重建光譜校正等來消除。



5.4等位基因丟失的分析 

5.4.1當(dāng) PCR擴(kuò)增或單堿基延伸反應(yīng)的模板在引物結(jié)合區(qū)發(fā)生突變，阻礙引物結(jié)合，會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或引物延伸失敗，無法檢測到模板 DNA中本身存在的一個等位基因。 

5.4.3考慮有等位基因丟失可能時，需更換 DNA序列不同的引物進(jìn)行重新檢測。 

5.5非特異峰的分析 

5.5.1 PCR引物去除不全：表現(xiàn)為在電泳圖譜上出現(xiàn)的片段長度為比 PCR引物長度多 1個堿基的產(chǎn)物，為 Exo酶對 PCR引物消化不全，可加大 Exo酶量消化后去除。 

5.5.2 ddNTP去除不全：未經(jīng)消化的 ddNTP常出現(xiàn)在大于70bp的位置，超量的ddNTP也會出現(xiàn)在較短片段位置，為SAP對未結(jié)合的熒光素標(biāo)記的 ddNTP消化不完全所致，可通過加大 SAP量消化后去除，由于 ddNTP是熒光素標(biāo)記的，該原因?qū)е碌念~外峰也稱為染料峰。 

5.5.3熒光污染：由于抗菌素、維生素、多環(huán)芳香族化合物、熒光助色物質(zhì)、各種紡織染料等有熒光，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異峰也稱熒光污染峰，通常比較寬，擁有較寬的熒光光譜范圍，可通過有機(jī)提取法去除。 

5.5.4其它：還有由氣泡、尿素結(jié)晶或電壓波動引起的非特異峰稱為偽峰，通常尖聳且出現(xiàn)在四種顏色的相同位置，沒有重復(fù)性。 

6 SNP分型結(jié)果表示

分型結(jié)果的描述： SNP檢驗結(jié)果以表格的形式列出，標(biāo)明檢材或樣本的編號、 SNP名稱及等位基因分型。等位基因以 A、C、G、T表示，等位基因間以“/”分隔；純合子只標(biāo)出 

1個；未得到分型或無法明確判定分型的標(biāo)為“-”。 

 

7 SNP分型結(jié)果應(yīng)用 

7.1補(bǔ)充個人識別鑒定 STR基因座被廣泛應(yīng)用于 DNA數(shù)據(jù)庫建立和實際案件鑒定的個體識別。當(dāng)犯罪現(xiàn)場提取的物證為降解檢材時， SNP分型結(jié)果可作為補(bǔ)充鑒定應(yīng)用于個體識別，即通過比較案發(fā)現(xiàn)場收集到的法醫(yī)物證檢材與嫌疑人的 SNP遺傳標(biāo)記，判斷前后兩次或多次出現(xiàn)的個體是否為同一個體。若兩份檢材的 SNP分型不同，可判斷兩份檢材不是來自同一個體；若 SNP分型相同，則稱為兩份檢材的 SNP分型匹配，即不能排除兩份檢材來自同一個體。 

7.2 輔助親緣關(guān)系鑒定當(dāng) STR系統(tǒng)的分型結(jié)果不足以確定某些復(fù)雜親緣關(guān)系時， SNP可以作為補(bǔ)充鑒定的遺傳標(biāo)記。常染色體 SNP符合孟德爾遺傳規(guī)律，即子代的等位基因一個來自于父親，一個來自于母親。在有爭議的父母和孩子三份樣本所檢測的多個 SNP分型結(jié)果中，孩子的一對等位基因分別在有爭議父母的基因型中找到來源時，不排除該有爭議父母為孩子的生物學(xué)父母。 Y染色體、X染色體和線粒體SNP可在某些特殊的親緣關(guān)系鑒定中作為補(bǔ)充鑒定的遺傳標(biāo)記使用。 

 

8 SNP分型結(jié)果評估 

8.1個人識別



8.1.1 匹配。兩份檢材所檢測的多個 SNP均相同時判斷為匹配。兩份檢材遺傳標(biāo)記分型匹配有兩種可能的原因：①兩份檢材來自同一個體；②兩份檢材不是來自同一個體，理論上可能來自群體中的一名隨機(jī)個體，僅僅因其遺傳標(biāo)記碰巧相同而出現(xiàn)了匹配。此時可以通過計算匹配概率來估計一個理論上的隨機(jī)個體碰巧匹配的可能性有多大。匹配概率按附錄 B計算，似然率按附錄 C計算。 

8.1.2 不匹配。在排除拔起峰、等位基因丟失、非特異峰等前提下，兩份檢材在所檢測的 SNP中有兩個及以上不同時判斷為不匹配。 

8.1.3 兩份檢材在所檢測的 SNP中只有一個不同時，不能排除兩份檢材來自同一個體，需增加檢測更多 SNP。增加檢測更多 SNP后，兩份檢材在所檢測的 SNP中有兩個及以上不同時判斷為不匹配。 

8.2 親子鑒定 

SNP作為親子鑒定的補(bǔ)充遺傳標(biāo)記。累積非父排除概率和累積父權(quán)指數(shù)按 GA/T 965－2011或 SF/Z JD0105001－2010中的要求計算。對于不符合遺傳規(guī)律的 SNP，PI取值可為 0.00001. 

8.3 SNP與 STR的同時使用

當(dāng) SNP與 STR同時使用時，或多個 SNP同時使用時，需有證據(jù)表明 SNP與 STR是相互獨(dú)立的，或 SNP之間是相互獨(dú)立的。不能證明相互獨(dú)立時按單倍型計算。

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